永生化人Ⅱ型肺泡上皮细胞（atii细胞）

Ⅱ型肺泡细胞（ATⅡ，又称颗粒肺泡细胞）是肺泡上皮的重要组成部分，散布于Ⅰ型肺泡细胞（ATⅠ）之间及肺泡间隔交界处。ii型肺泡上皮细胞体积较小，呈立方形，表面轻度凸向肺泡腔，细胞核大而圆，胞质染色相对淡浅，常可见空泡结构。其游离面分布有大量短小微绒毛，尤其在边缘区域更为密集。虽然数量上多于ATⅠ（约占肺泡上皮细胞总数的14%~16%），但仅覆盖约5%的肺泡表面积。ATⅡ细胞胞质中富含线粒体和粗面内质网，并含有板层体、多泡体及溶酶体；ii型肺泡上皮细胞膜表面具有MPA凝集素，可特异性识别α-半乳糖残基。相邻细胞通过紧密连接和中间连接保持完整屏障功能。

ATⅡ的分化与增殖受多种信号通路调控，例如Notch等信号途径在肺泡稳态和修复中具有重要作用。

在功能方面，ATⅡ细胞兼具多重作用

ATⅡ细胞是肺泡上皮的“干细胞”，能够自我复制以补充同类细胞，同时分化为ATⅠ细胞，维持肺泡的结构与功能；
ATⅡ细胞合成并分泌肺表面活性物质，从而降低肺泡表面张力，避免肺泡塌陷；
ATⅡ细胞还参与肺部液体的转运，并在免疫防御中发挥关键作用。

ATⅡ细胞来源具有发育阶段和成体稳态的差异性

在胚胎期，ATⅠ和ATⅡ细胞均起源于双能前体细胞，这类前体细胞能够在肺发育后期分化为两类肺泡上皮细胞。胎儿约25周时，支气管远端形成原始肺泡，ATⅡ细胞逐步出现，随后ATⅠ细胞数量逐渐增加，肺泡趋于成熟。成体阶段，ATⅡ细胞通过自身增殖维持数量，同时在损伤修复过程中，部分Ⅱ型细胞还可来源于支气管肺泡干细胞（BASCs）及细支气管棒状细胞，它们在肺损伤后迁移至肺泡并分化为ATⅡ，从而参与修复。需要注意的是，ATⅠ细胞通常不会逆向转化为ATⅡ细胞。

永生化人ii型肺泡上皮细胞特性特征

ATⅡ细胞特异性表达肺表面活性物质相关蛋白（Surfactant Proteins），主要有SP-A、SP-B、SP-C和SP-D，尤其是SP-C的表达高度特异。
ATⅡ细胞含有丰富的线粒体和粗面内质网，能合成大量的表面活性物质。
ATⅡ细胞表面表达MPA凝集素，可以特异结合α-半乳糖残基。
ATⅡ细胞含有丰富的板层体，是分泌表面活性物质的细胞器。
ATⅡ细胞表达转录因子TTF-1（甲状腺转录因子1，NKX2-1），它调控肺泡Ⅱ型上皮细胞的表型和表面活性蛋白的表达，是维持其干性和功能的关键分子。
ATⅡ细胞相关磷脂合成功能基因丰富，以支持表面活性物质的合成。
ATⅡ细胞还表达细胞干性相关基因，赋予其增殖和分化能力。
通过单细胞测序显示，ATⅡ细胞表达肺泡Ⅱ型特异性基因Sftpc（SP-C编码基因）、Sftpb等，同时与肺泡Ⅰ型细胞表达基因如Aqp5明显区分。
Brg1基因在ATⅡ细胞中表达，对细胞染色质重构、基因表达调控及细胞增殖分化有重要作用。
ATⅡ细胞表达多种细胞连接蛋白，如紧密连接蛋白和中间连接蛋白，确保肺泡上皮屏障完整性。
ATⅡ细胞具备免疫相关基因的表达，参与肺部的免疫防御功能。

永生化人ii型肺泡上皮细胞参数表

细胞名称	永生化人Ⅱ型肺泡上皮细胞（atii细胞）
细胞形态	立方形或圆形，细胞核大而圆，胞质浅染，含丰富颗粒和板层体
细胞体积	约900 μm³
数量占比	占肺泡上皮细胞14%～16%，覆盖肺泡表面约5%
位置分布	散在于Ⅰ型肺泡细胞之间及肺泡间隔结合处
细胞表面	游离面有大量短微绒毛，含MPA凝集素，特异结合α-半乳糖残基
细胞间连接	紧密连接和中间连接
细胞内结构	丰富的线粒体、粗面内质网、多泡体、溶酶体和板层体
表面活性物质蛋白表达	SP-A、SP-B、SP-C、SP-D（肺表面活性蛋白，尤其SP-C为特异标志）
关键转录因子	TTF-1（NKX2-1），调控细胞分化和表型
其他基因表达	Sftpc（SP-C编码基因）、Brg1（染色质重构关键基因）、干细胞相关基因
免疫与信号分子表达	多种免疫调节因子和细胞连接蛋白，如紧密连接蛋白
接种密度	约1×10^6个/ml（悬浮液），贴壁培养时约4×10^5个/cm²
培养基	人Ⅱ型肺泡上皮细胞永生化专用培养基
培养环境	37℃，5% CO₂
贴壁时间	12-18小时
传代时机	细胞密度约80%时，平均传代周期7-10天
传代次数	可传代3-4代（约35天），多代后活力下降
纯度	纯度一般>80%-98%，取决于分离方法
活力	活力>90%，使用锥虫蓝染色等法检测
分泌功能	分泌肺表面活性物质，主要为二棕榈酰卵磷脂和蛋白质
表面活性物质表达维持时间	SP-A及SP-C可维持表达约24天，SP-B、SP-D表达可达28天
干细胞特性	能自我复制，能分化为Ⅰ型肺泡细胞，参与肺泡结构维护
免疫功能	参与肺部免疫防御和炎症反应
研究领域	肺部疾病机制研究、肺损伤修复、细胞再生、肺部药物筛选
应用细胞模型	原代细胞、永生化细胞株、iPSC衍生细胞用于体外实验和药物测试

培养教程

永生化人Ⅱ型肺泡上皮细胞培养教程

ATII细胞复苏（Thawing）

配制并预热 5 ml完全培养基（基础培养基 + 10%胎牛血清 + 1%抗生素），置于37℃水浴中备用。
将37℃水浴锅提前预热，用于ATII细胞快速解冻。
从液氮罐或 -80℃冰箱中迅速取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中，轻轻摇动，使ATII细胞悬液快速解冻（约1分钟）。
解冻完成后，立即将细胞悬液转移至含有预热完全培养基的15 ml离心管中。
1000 rpm离心4–5分钟，弃去上清液以去除DMSO。
用2 ml完全培养基轻轻重悬ATII细胞，并转移至T25培养瓶或培养皿中。
将培养瓶放入 37℃、5% CO₂培养箱中培养。
约24小时后更换新鲜培养基，去除未贴壁及死亡ATII细胞，并观察细胞形态和贴壁情况。

ATII细胞传代（Subculture）

当ATII细胞密度达到80%–90%融合时，弃去旧培养基。
用无钙、无镁PBS缓冲液清洗1–2次，以去除残留血清成分。
向培养瓶中加入1 ml 0.25%胰酶-EDTA溶液，置于37℃培养箱中消化约1–2分钟。
在显微镜下观察，ATII细胞逐渐变圆、松散并开始脱落时，立即加入等体积完全培养基终止消化。
轻轻吹打细胞悬液，使ATII细胞分散均匀。
以1000 rpm离心4–5分钟，弃去上清液。
用新鲜完全培养基重悬ATII细胞，并按照 1:2至1:6比例接种到新的培养瓶中。
放入培养箱继续培养，定期观察ATII细胞状态。

ATII细胞冻存（Cryopreservation）

选择状态良好、处于对数生长期的ATII细胞进行冻存。
传代后收集ATII细胞并计数，调整细胞密度至 1×10⁶个/ml。
预冷冻存液配方为：90%完全培养基 + 10% DMSO。
用冻存液充分重悬ATII细胞。

冻存步骤

将ATII细胞悬液分装至冻存管中，确保密封良好。
将冻存管置于程序降温盒中，在 -80℃冰箱中过夜，确保降温速率约为 -1℃/分钟。
次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存，以保证ATII细胞活性