原代小鼠真皮成纤维细胞（Mouse Dermal Fibroblasts, MDF）是从小鼠皮肤真皮组织中分离得到的重要细胞类型，广泛用于生物医学研究。其前体来源于胚胎时期中胚层的间充质细胞，通过酶消化或机械分离技术获得，常用实验小鼠品系包括C57BL/6。刚分离的细胞在培养基中呈圆形，折光性强，短时间内完成贴壁，逐渐伸展为梭形或星形；小鼠真皮成纤维细胞常用于组织工程、创伤修复、皮肤病理学和药物研发中，特别是在创伤修复研究中可评估新型材料或药物的调节作用。

小鼠原代真皮成纤维细胞特性特征

• 基因表达：表达多种与细胞外基质合成相关的基因，如COL1A1（I型胶原蛋白）、COL3A1（III型胶原蛋白）和HAS2（透明质酸合成酶）等。

• 标志物：通过免疫荧光鉴定，真皮成纤维细胞通常表达Vimentin，这是一种中间丝蛋白，是成纤维细胞的重要标志物。此外，它们不应含有HIV-1、HBV、HCV等病原体。

• 生长因子：在创伤愈合过程中，原代真皮成纤维细胞能够分泌多种生长因子，如转化生长因子β（TGF-β）和血小板源生长因子（PDGF），促进周围细胞的增殖和迁移

小鼠原代真皮成纤维细胞参数表

小鼠原代真皮成纤维细胞培养教程

MDF细胞复苏

• 预热37℃水浴槽和含10%胎牛血清的DMEM培养基。

• 将0.2%明胶包被的培养瓶准备好，置于培养箱中平衡温度和气体环境。

• 从液氮罐中取出冻存的MDF细胞冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇动使细胞解冻（约1-2分钟）。

• 解冻后迅速用75%乙醇擦拭冻存管表面，移至无菌操作台内。

• 将细胞悬液转移到15 mL离心管中，加入5倍体积预热的DMEM培养基稀释DMSO，400 g离心5分钟，弃去上清液。

• 将细胞沉淀重悬于1-2 mL培养基中，接种到预包被的T25培养瓶中，并补充培养基至5 mL。

• 将培养瓶置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，6小时后更换新鲜培养基去除残余DMSO。

MDF细胞传代

• 传代的细胞密度：当细胞融合度达到70%-80%时进行传代。

• 消化液：使用0.25%胰酶-EDTA（预热至37℃）。

• 掉旧培养基，使用PBS轻柔清洗细胞1次以去除残余血清和代谢废物。

• 加入适量胰酶-EDTA溶液（约1 mL/25 cm²），37℃孵育约1-2分钟，观察显微镜下细胞变圆脱离。

• 加入等体积含10%胎牛血清的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打使细胞分散。

• 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，400 g离心5分钟，弃上清后重悬于新鲜培养基中。

• 按1:3的比例接种到新的培养瓶中，并补充适量培养基后置于培养箱继续培养。

• 消化时间不宜过长，以防止对MDF细胞造成损伤。

• 每次传代后应观察细胞状态，记录贴壁时间及增殖速率，确保细胞保持良好活性。

MDF细胞冻存

• 收集处于对数生长期的MDF细胞，按常规方法消化并离心收集细胞沉淀。

• 用预冷的冻存液将细胞重悬，细胞密度调整至1×10⁶~2×10⁶个/mL。

• 分装细胞悬液到无菌冻存管中，每管1 mL。

• 将冻存管放入程序降温盒中，-80℃保存过夜后转移至液氮中长期储存。

• 冻存细胞时应确保冻存液与细胞混匀，避免细胞结团。

• 液氮储存时确保液位充足，避免因温度波动影响MDF细胞存活率。