大鼠外周血单个核细胞（rat peripheral blood mononuclear cells, rat PBMCs）是大鼠外周血中分离获得的具有单一核结构的免疫细胞群体，主要包括淋巴细胞（如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞）以及单核细胞。单核细胞在机体免疫应答、炎症调控和组织修复等过程中发挥关键作用。常用的分离方法是密度梯度离心法，利用Ficoll-Paque等分离介质，通过离心将红细胞和粒细胞沉降，而在血浆与分离液界面富集的即为PBMCs细胞。

在实际应用中，外周血除作为普通血液成分外，也可通过促动员手段将骨髓中的造血干细胞释放入血液循环，从而作为干细胞来源被采集和分离，这一策略在“生命方舟”等研究项目中曾得到广泛应用，并推动了“外周血”作为干细胞来源的新概念的提出。

大鼠外周血单个核细胞特性特征

• 细胞组成：属于外周血单个核细胞（PBMC）群体，包含淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）和单核细胞，其中单核细胞是大颗粒的免疫细胞。

• 形态特征：单核细胞表现为中等至大型的圆形细胞，具有单一椭圆形或肾形核，胞质丰富。

• 功能特性：具备吞噬、抗原递呈和分泌细胞因子的能力，是先天免疫和适应性免疫的桥梁细胞，能分化为巨噬细胞和树突状细胞。

• 来源稳定：通过密度梯度离心法等经典方法，从大鼠的外周血样本中稳定分离获得。

• 免疫活性强：在炎症反应、免疫监视和组织修复中发挥关键作用。

• 细胞表面标志物：单核细胞特异性表达CD14（LPS受体）、表达其他免疫相关分子如CD11b、CD68、MHC II分子（主要组织相容性复合体II类分子）。

• 细胞因子分泌：能分泌多种促炎和抗炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、转化生长因子β（TGF-β）等。

• 受体表达：表达模式识别受体如Toll样受体（TLRs），可识别病原体相关分子模式（PAMPs）并启动免疫反应。

• 抗原提呈能力：高表达MHC II分子，具备抗原递呈能力，能激活T细胞。

• 基因表达谱：表达与免疫调节、信号转导、细胞迁移和分化相关的基因。典型基因如CD14、CD68、CCR2、IL1B、TNFA等高度表达。

• 分化潜能：可表达调控单核细胞分化为巨噬细胞或树突状细胞的转录因子，如PU.1、IRF8等。

• 应激反应基因：在激活状态下，调控细胞因子合成和炎症反应相关基因的表达。

大鼠外周血单个核细胞参数表

原代大鼠外周血单个核细胞培养教程

PBMC细胞的复苏流程

• 迅速将冻存的PBMC细胞从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴中，轻柔摇晃1–2分钟；

• 解冻至仅余少量冰晶时，立刻转移至离心管中，避免DMSO对细胞造成毒性。

• 加入10 mL预温完全培养基稀释细胞，1000 rpm离心5分钟；

• 弃上清后，以5 mL新鲜培养基轻柔重悬PBMC细胞。

• 将PBMC细胞接种于培养瓶中，于37℃、5% CO₂培养箱中静置孵育；

• 培养24小时后可更换一部分培养液，去除死细胞和碎片，稳定悬浮或贴壁状态。

PBMC细胞的传代培养

• 使用倒置显微镜观察PBMC细胞的形态与密度，若细胞密度达到0.5–1×10⁶ cells/mL，且活性良好，则可考虑传代。

• 轻轻吹打培养液，使PBMC细胞均匀悬浮；

• 收集细胞，1000 rpm离心5分钟，去除废液。

• 用新鲜预热的完全培养基按1:2或1:3比例重悬PBMC细胞；

• 接种至新培养瓶或孔板中，可视需要选用低吸附培养皿或涂层板（如纤连蛋白）促进贴壁。

• 继续在37℃、5% CO₂湿润培养箱中培养，定期观察细胞状态并适时更换部分培养基。

PBMC细胞的冻存步骤

• 选择活性良好、处于对数生长期的PBMC细胞；

• 离心收集细胞沉淀，弃去上清液。

• 使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，调整浓度至5×10⁶ ~ 1×10⁷ cells/mL。

• 配制90%胎牛血清 + 10% DMSO的冻存液，4℃预冷。

• 将PBMC细胞缓慢混入冻存液中，轻柔混匀，避免产生气泡；

• 分装1 mL/管至已标记的冻存管中。

• 将冻存管放入程序降温盒（如Mr. Frosty），-80℃缓慢降温过夜（约1℃/分钟）。

• 第二天将冻存管转入液氮罐中储存，以维持PBMC细胞的长期生物活性。

附加建议

• 培养基优化：可根据实验设计添加细胞因子（如M-CSF、GM-CSF）诱导PBMC细胞向巨噬细胞或树突状细胞方向分化。

• 注意事项：PBMC细胞属于原代细胞，天然不具备无限增殖能力，建议仅在必要时进行有限传代。

• 操作温和：PBMC细胞对剪切力较敏感，传代与离心操作需轻柔。

• 实验规划：PBMC细胞生命周期有限，应根据实验时间点科学安排培养与使用。