大鼠骨骼肌原代细胞主要来自四肢肌肉组织。大鼠骨骼肌细胞为长柱状、多核细胞，其细胞核沿细胞膜排列，细胞内则平行排列着细丝状的肌原纤维，呈现出明显的横纹结构。肌原纤维上，浅色的Ⅰ带与深色的A带交替分布，A带中央存在较亮的H线及其中心的M线，而Ⅰ带中央则由较暗的Z线分隔成肌节，构成了肌肉收缩的基本单位。

大鼠骨骼肌原代细胞（Primary Rat Skeletal Muscle Cells，英文缩写RSkMC4）系从健康大鼠肢体骨骼肌组织中，通过采用复合酶消化法（通常联合使用I/II/IV型胶原酶与Dispase）分离获得，并经过70μm滤网过滤以提升细胞纯度。骨骼肌细胞在无血清培养液重悬下可减少分化抑制，从而提高细胞活性。由于原代细胞在基因表达谱上与永生化细胞系存在显著差异，原代细胞更适合于生理机制的探讨，而诸如L6细胞系则适于高通量代谢实验。

原代大鼠骨骼肌细胞特性特征

• 细胞形态：呈纤维状，不分支，有明显横纹。

• 核位置：多核，核位于细胞膜下方。

• 细胞排列：具有方向性，呈梭形或长梭形，平行排列。

• 传代能力：可传3-5代。

• 免疫荧光鉴定：α-肌动蛋白（α-actin）免疫荧光染色阳性，纯度高于90%。

• 其他相关蛋白：可能表达肌球蛋白等肌肉特异性蛋白。

• 肌肉特异性蛋白：表达肌动蛋白、肌球蛋白等特异性蛋白。

• 代谢特征：具有较高的胰岛素敏感性，适合用于研究肌肉代谢调控。

• 基因表达谱：与永生化细胞系（如L6）相比，原代细胞的基因表达谱更接近自然状态，适合用于研究肌肉生理机制。

• 研究应用：适用于肌肉生理、疾病模型构建、药物筛选等领域。

• 实验特点：在高通量代谢实验中不如永生化细胞系，但在研究肌肉生理机制时更具优势

分子特征

功能特性对比

大鼠骨骼肌原代细胞参数表

大鼠骨骼肌原代细胞培养教程

骨骼肌细胞复苏

• 从液氮中取出预冻保存的骨骼肌细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻。整个解冻过程中需轻柔摇动，确保骨骼肌细胞均匀受热，但避免剧烈震荡，以降低对骨骼肌细胞的损伤风险。

• 待骨骼肌细胞完全解冻后，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，快速稀释细胞悬液中的DMSO。混合均匀后，将骨骼肌细胞悬液转入15 mL离心管中，以1000 RPM离心4分钟，弃去上清液，从而有效去除DMSO，保护骨骼肌细胞活性。

• 用1～2 mL新鲜培养基轻柔重悬骨骼肌细胞，确保细胞充分分散。随后，将重悬后的骨骼肌细胞接种于T25培养瓶中，补加约8 mL培养基，并置于37℃、5% CO₂培养箱中，过夜培养使骨骼肌细胞稳定贴壁生长。

骨骼肌细胞传代

• 在传代前，应观察骨骼肌细胞的生长状态，当细胞融合度达到70%～80%时为最佳传代时机。此时，先更换新鲜培养基以清除培养过程中产生的代谢废物和未贴壁的细胞，确保骨骼肌细胞处于最佳状态。

• 使用0.25%胰蛋白酶对骨骼肌细胞进行消化，消化时间约为5～10分钟，直至骨骼肌细胞开始脱离培养瓶底。消化过程中应随时观察，防止骨骼肌细胞因消化过度而受损。

• 将消化后的骨骼肌细胞悬液转入离心管中，以1000 RPM离心4分钟后弃去上清液。利用新鲜培养基将骨骼肌细胞轻柔重悬，根据实验要求调整接种密度（常设为0.5×10⁶ cells/mL），并播种于新培养瓶中，确保骨骼肌细胞均匀分布并维持良好的生长状态。

骨骼肌细胞冻存

• 在传代过程中，将胰蛋白酶处理后的骨骼肌细胞收集于离心管中，利用血球计数板进行计数，确定冻存所需的细胞数。一般建议冻存密度设定在1×10⁶至1×10⁷个活细胞/mL，以确保每管骨骼肌细胞数量充足。

• 以1000 RPM离心3～5分钟去除上清液后，配制冻存液。常用冻存液比例为60%培养基、30% FBS和10% DMSO，此配方可有效保护骨骼肌细胞在低温下免受冰晶损伤。

• 将离心后的骨骼肌细胞均匀重悬于冻存液中，并分装到冻存管中，每管内含1×10⁶至1×10⁷个活细胞。

• 将装有骨骼肌细胞的冻存管置于程序降温盒中，在-80℃冰箱中过夜，使温度逐步降低，随后转移至液氮容器中长期保存，以保证骨骼肌细胞活性长期维持。