大鼠骨髓间充质干细胞（原代细胞）

大鼠骨髓间充质干细胞（简称BMSC细胞）是一种来源于中胚层的成体干细胞，具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，能够分化为骨、软骨、肌肉、脂肪、神经等多种组织细胞，被广泛应用于细胞生物学研究、组织工程、细胞替代治疗、基因治疗及组织器官再造等领域。BMSC细胞主要从骨髓中分离，骨髓作为造血和免疫器官，分布于长骨（如股骨、胫骨）和扁平骨（如髂骨）的骨髓腔及稀松骨质间，具有海绵状结构。成年动物骨髓分为红骨髓和黄骨髓，红骨髓可生成红细胞、血小板和各种白细胞，承担造血和免疫功能；随着年龄增长，红骨髓部分被脂肪细胞替代形成黄骨髓，仅在某些扁平骨中保留红骨髓。骨髓间充质干细胞占骨髓有核细胞总数的比例极低，仅为0.001%-0.1%。BMSC细胞在治疗衰老相关疾病中表现出潜力，例如通过过表达TPP1改善老年大鼠BMSCs的衰老状态，提高其治疗缺血性心肌病的效果。

大鼠骨髓间充质干细胞特性特征

多向分化潜能：具有多向分化潜能，在体外诱导后可特异性染色显示脂质沉淀和骨结节，表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.
自我复制能力：具有自我复制功能，能够释放多种祖细胞，再分化为各种功能性的细胞，如肝细胞、骨细胞、脂肪细胞及内胚层来源的细胞.
表面标志物：表面分子CD29、CD44和CD90表达均高于95%；而造血系干细胞标记分子CD34和CD45表达低于5%.
其他特征：骨髓间充质干细胞还具有较高的增殖能力。在不同诱导条件下，可向中胚层细胞如脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等分化

大鼠骨髓间充质干细胞参数表

细胞名称	原代大鼠骨髓间充质干细胞 ( BMSCs)
英文名称	rat bone marrow mesenchymal stem cells
来源	中胚层，分离自骨髓
细胞形态	通常情况下，BMSC会呈现长的纺锤或成纤维细胞形态，细胞中央有卵圆形核，密度较高时呈涡旋状或放射状生长。但随着分裂次数的不断增加，BMSC会逐渐变得大而扁平，也就是常说的衰老形态。
主要功能	对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）
含量	在骨髓中，BMSC 占骨髓有核细胞总数的 0.001%-0.1%，含量极低
培养基	原代细胞专用培养基
培养温度	37℃
CO₂ 浓度	5%
传代间隔	2-3 天，或当细胞融合度达到 90% 左右时
传代比例	1:2 或 1:3
贴壁时间	受贴壁时间影响
种植密度	受种植密度影响
培养基pH值	受培养基pH值影响
最适培养基	DMEM-LG培养基较适合大鼠BMSCs的生长，形态均一、克隆形成时间和第1次传代时间短、克隆形成数量多、细胞贴壁率高
对数生长期	仅需4 d
表面标志物（阳性）	CD29, CD44, CD90, CD73, CD105, CD106 表达阳性25。CD90 阳性率 >95%。
表面标志物（阴性）	CD34, CD45, CD14, HLA-DR 表达阴性12。CD34, CD45 阳性率≤5%。
黏附分子家族	CD166 , CD102 , CD54和 CD50
整合素家族分子	CD49a , CD49b , CD49c , CD29和 CD104
细胞因子受体家族	白细胞介素受体、干扰素受体、肿瘤坏死因子 A
分化潜能	可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等间充质细胞。而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元神经胶质细胞和内胚层的肝细胞、内皮细胞。
细胞指数倍增时间(CIDT)	CIDT ≤ 50 与正向分化潜能相关
最大相对细胞指数(RCImax)	RCImax ≥ 0.8 与正向分化潜能相关
达到 50% CImax 所需的时间(GT50)	GT50 随时间变化的斜率 S < 6 与正向分化潜能相关的阈值
冻存液组成	血清:DMSO=9:1
细胞增殖	BMSCs 在多次传代后增殖速率降低
质量控制评估	通过 Agilent xCELLigence 仪器分析定量参数
骨质疏松性椎体骨折	移植BMSCs可影响骨碱性磷酸酶（BALP）/Ⅰ型胶原交联C-末端肽（CTX-1）表达与力学动态
免疫调节功能	通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；Gal-3能够单独诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化

培养教程

原代大鼠骨髓间充质干细胞培养教程

BMSC细胞复苏

从液氮罐中迅速取出冻存的BMSC细胞，确保细胞受冻时间最短。
立即将冻存管置于37℃水浴锅中快速解冻，轻轻摇晃，在1-2分钟内使细胞完全融化。
在无菌操作台内，用移液器将BMSC细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入5 mL新鲜完全培养基稀释。
以1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
加入5 mL新鲜培养基重悬细胞，将BMSC细胞接种到一次性细胞培养瓶（25 cm²）中。
将培养瓶置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，并注意培养基的pH稳定性。
每2天更换一次培养液，观察BMSC细胞贴壁生长情况。

BMSC细胞传代

当BMSC细胞贴壁生长且细胞融合度达到80%-90%时，可进行传代操作。
弃去培养瓶中的旧培养液，使用无钙镁的PBS缓冲液清洗细胞3次，去除残余培养基。
加入适量0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻摇晃培养瓶，同时在倒置显微镜下观察细胞的变化。当BMSC细胞间连接消失、细胞呈游离状态时，迅速加入等量的完全培养基终止消化。
将细胞悬液转移至离心管中，以1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
用新鲜培养基重悬细胞，计数后按照一定比例（如1×10⁵细胞/mL）接种到新的培养瓶中。
加入适量完全培养基（如5 mL/25 cm²培养瓶），置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

BMSC细胞冻存

选择生长良好、处于对数生长期的BMSC细胞进行冻存。冻存前24小时更换新鲜培养基，确保细胞处于良好状态。
用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将BMSC细胞消化至游离状态后，加入等量培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中。
以1000 rpm离心5分钟，弃去上清液，加入预冷的冻存液（血清:DMSO=9:1），轻轻吹打使BMSC细胞分散均匀。
调节细胞浓度为5×10⁶~1×10⁷个/mL，将细胞悬液分装至冻存管中，每管1 mL。
将冻存管密封，并贴上标记清晰的标签（包括“BMSC细胞”种类、冻存日期等信息）。
将冻存管置于4℃环境下预冷30分钟，随后转移至-20℃冰箱4小时，再转入-80℃冰箱中过夜。最终，将BMSC细胞转移至液氮罐（-196℃）中长期保存。

BMSC细胞培养基

推荐使用专用的完全培养基（如含10%胎牛血清的DMEM培养基），同时确保培养环境为37℃、5% CO₂，培养基需每2-3天更换一次。