原代大鼠表皮角化上皮细胞（Keratinocytes, KCs）是从大鼠正常皮肤组织中提取的细胞，主要用于皮肤生物学、药物筛选及毒理学研究。大鼠表皮角化上皮细胞来源于大鼠表皮的基底层和棘层，通过酶消化法进行分离，常用酶包括胶原酶和胰酶，经过处理后可获得纯度高于90%的角化细胞。角化细胞为复层鳞状上皮细胞，贴壁生长，形态多呈多角形或扁平状，具备较强的分化能力，随着向表层移动逐渐失去分裂活性并形成角质层。在体外培养过程中，通常采用广谱角蛋白（Pan Cytokeratin）免疫荧光染色进行鉴定，以确认其为角化细胞并确保纯度。

表皮角化上皮细胞特性特征

• 分化过程：从基底层到表面，角化细胞经历基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层的分化过程，随着向表层的推移，细胞的形态和功能逐渐变化。

• 角蛋白表达：角化细胞主要表达多种类型的角蛋白（如K17、K14等），这些角蛋白在细胞的分化和功能中起着重要作用。K17在银屑病等皮肤病中的表达显著增加。

• 粘附分子：表皮角化上皮细胞能够产生粘附分子和细胞因子，这些物质与天然免疫和体内稳态相关。

• 基因表达：原代大鼠表皮角化细胞在不同阶段的分化过程中，其相关基因（如p63、CK-14）会被激活或抑制，反映出其增殖与分化状态。

• 转录因子：p63作为表皮干细胞标志物，在维持表皮干细胞的增殖和自我更新中发挥关键作用

大鼠表皮角化上皮细胞参数表

原代大鼠表皮角化上皮细胞培养教程

细胞分离步骤

• 在无菌条件下，从成年大鼠获取皮肤组织，并剪成约1 cm²的小块，以增加表皮角化上皮细胞的分离效率。

• 将皮肤组织置于含有0.1%胰蛋白酶和胶原酶的混合消化液中，放置在37°C水浴中消化1-2小时，期间轻轻摇动以促进表皮角化上皮细胞的释放。

• 为进一步分散细胞，加入透明质酸酶消化30分钟，增加表皮角化上皮细胞的分离效率。

• 将消化后的细胞混合物通过70μm细胞滤器进行过滤，以去除未消化的组织块，并收集表皮角化上皮细胞。

• 过滤后的细胞悬液转移至离心管，以1400 rpm离心8分钟，收集沉淀的表皮角化上皮细胞。

细胞重悬与接种

• 使用无血清培养基将收集的表皮角化上皮细胞沉淀重悬，并调整细胞浓度至 $1 \times 10^7$ cells/cm²。

• 将重悬的表皮角化上皮细胞接种于预先包被I型胶原的培养板或培养皿中，以促进细胞贴壁和生长。

• 接种后，将培养皿放置于37°C、5% CO₂的培养箱中，静置1-2小时以确保表皮角化上皮细胞贴壁。

培养与维护

• 接种后48小时进行首次换液，以去除未贴壁的表皮角化上皮细胞及残留的消化酶。此后每天更换新鲜培养基，维持表皮角化上皮细胞的生长状态。

• 每日观察表皮角化上皮细胞在显微镜下的生长状态，记录细胞形态变化和贴壁情况。表皮角化上皮细胞呈多角形或扁平状，并具有明显的贴壁生长特征。

• 当表皮角化上皮细胞达到80%-90%汇合时，使用0.05%胰蛋白酶消化细胞，传代比例通常为1:2或1:3。传代过程中，轻轻拍打培养皿以促进表皮角化上皮细胞的脱落，并避免过度消化。

注意事项

• 操作过程中，需保持严格的无菌环境，防止表皮角化上皮细胞污染。

• 在细胞培养初期，应密切观察表皮角化上皮细胞的生长状态，如发现异常（如形态变化、细胞死亡或污染），应及时处理。

• 使用专用的无血清培养基，确保表皮角化上皮细胞培养条件的稳定性和一致性，并遵循制造商提供的使用说明。

• 传代后应重新补充培养基中的生长因子，维持表皮角化上皮细胞的增殖和分化能力。

• 进行常规的病原体检测，以确保表皮角化上皮细胞培养的安全性，排除HIV、HBV、HCV等常见污染风险。