3D4/21猪肺泡巨噬细胞系于1998年从27日中龄猪的肺中分离获得，母细胞为3D4猪肺泡巨噬细胞。通过pSV3neo溶液转染并携带新霉素抗性基因和SV40大T实现了永生化。转染后的细胞经过G418筛选后，成功克隆出多个亚群，包括3D4/2、3D4/21和3D4/31。每个亚群都在非磷酸酯酶活性和发挥作用方面的其中，3D4/21细胞亚群在病毒复制方面极为突出，能够有效地产生牛腺病毒3型（BAV-3），并添加二甲基亚硫酰胺；3D4/21细胞系具有典型的巨噬细胞形态，表现出强烈的贴壁生长特性，全面增强免疫学、病毒学及其他生物医学。

3D4/21细胞特性特征

• 转染质粒：3D4/21细胞使用pSV3neo质粒转染，该质粒携带新霉素抗性基因和SV40大T抗原。

• 酶活性：3D4/21细胞在非特异性酯酶活性和吞噬作用方面表现出阳性反应。

• 病毒易感性：可感染多种病毒，包括牛腺病毒3型（BAV-3）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、人副流感病毒3；Swinepox病毒；水疱性口炎新泽西病毒；猪腺病毒；单纯疱疹病毒1型；非洲猪瘟病毒；伪狂犬病病毒；痘苗病毒；猪水泡病病毒。

• 克隆3D4/21细胞对非洲猪瘟病毒的复制能力较强，添加DMSO可进一步提高其复制能力。

• 基因表达：由于转染了SV40大T抗原，3D4/21细胞系在增殖和存活方面具有优势，能够持续生长并保持稳定的表型。

• 抗性基因：3D4/21细胞携带的新霉素抗性基因使得该细胞系在含有G418的培养基中能够存活并增殖。

• 克隆3D4/21可以产生牛腺病毒3型（BAV-3），其滴度明显高于克隆3D4/2和3D4/31。

• 与其他克隆相比，添加DMSO提高了克隆3D4/21复制非洲猪瘟病毒（ASFV/Lillie）田间分离株的能力。

3D4/21细胞参数表

3D4/21猪肺泡巨噬细胞培养教程

细胞复苏步骤

• 准备4 mL预热的完全培养基，加入到15 mL离心管中。

• 从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的3D4/21细胞，迅速放入37℃水浴中解冻，轻轻摇晃，解冻过程约1分钟。

• 解冻后，将3D4/21细胞转移至含预热培养基的离心管中，1000 rpm离心5分钟。

• 吸弃上清液，轻轻重悬细胞于2 mL完全培养基中。

• 将重悬细胞转移至T25培养瓶中，放入37℃恒温培养箱，观察3D4/21细胞的生长状态。

• 24小时后，检查3D4/21细胞是否已贴壁并健康生长。如果需要，吸弃旧培养基，加入新鲜的完全培养基。

细胞传代步骤

• 当3D4/21细胞的汇合度达到80%-90%时，吸弃培养基，并用无菌PBS轻轻洗涤一次，去除残余培养基和血清。

• 向细胞培养瓶中加入1 mL 0.25%胰酶溶液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟。

• 观察3D4/21细胞收缩、变圆后，迅速加入1 mL完全培养基中止消化，并轻拍培养瓶，使细胞脱落。

• 将细胞转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5分钟。

• 吸弃上清液后，用完全培养基重悬细胞，按照1:2至1:5的比例分装至新的培养瓶中，继续培养3D4/21细胞。

细胞冻存步骤

• 按照传代方法收集3D4/21细胞沉淀，并取少量细胞进行计数。

• 用预冷的冻存液（90%完全培养基 + 10% DMSO）重悬细胞，细胞浓度调整为1 × 10^6个/mL。

• 将细胞悬液分装至冻存管中，每管约1.2 mL。

• 将冻存管放入程序冻存盒中，缓慢降温至-80℃过夜，然后转移至液氮罐中进行长期保存。

注意事项

• 在消化过程中，胰酶消化时间要控制在适当范围，以避免过度消化导致3D4/21细胞损伤。

• 所有操作过程应严格保持无菌条件，避免细胞污染。

• 细胞复苏和传代后，应尽快观察3D4/21细胞状态，保证细胞在良好状态下继续培养。