L-WRN细胞株（小鼠皮下结缔组织细胞株）

L-WRN小鼠皮下结缔组织细胞源自雄性C3H/An小鼠皮下结缔组织的成纤维样细胞。L-WRN细胞通过对L-Wnt3A（ATCC CRL-2647）细胞进行基因工程改造，转染了含有R-spondin 3和noggin共表达载体的细胞，从而使其能够稳定分泌Wnt-3A、R-spondin 3以及noggin。这些因子是培养和研究各种哺乳动物组织干细胞，特别是肠道类器官时不可或缺的。

L-WRN细胞株建立目的是为了提供高效、经济的条件培养基。相较于使用重组蛋白，L-WRN细胞株能够生产含有Wnt-3A、R-spondin 3和noggin的条件培养基，减少了大规模培养的成本。Wnt-3A能够结合到卷曲受体家族并激活β-catenin依赖性转录通路，而R-spondin 3作为Wnt信号通路的强效共激活剂，对于小肠干细胞的维持至关重要。Noggin则作为骨形态发生蛋白（BMP）信号的抑制剂，有助于在体外维持和传递小肠类器官。

L-WRN细胞株特性特征

基因表达：Wnt-3A、R-spondin 3 (R-海绵碱)、Noggin (诺金)
分泌特性：能够同时分泌Wnt、R-spondin和Noggin蛋白
基因工程改造：L-WRN细胞通过R-spondin 3和noggin共表达载体转染L-Wnt3A细胞（ATCC CRL-2647）获得、在含G418和潮霉素B的培养基中筛选稳定克隆
条件培养基来源：L-WRN细胞是生产Wnt-3A、R-spondin 3和noggin条件培养基的来源
应用价值：可用于培养各种哺乳动物组织干细胞，特别适用于肠道类器官的培养和研究
由于条件培养基中除了Wnt3A、R-spondin 3和noggin蛋白外还含有其他因子，因此有必要用来自大亲代细胞系的对照条件培养基来控制任何涉及Wnt3A条件培养基的实验使用L-WRN细胞（如CRL-3276）制备的条件培养基能提供相对完整且高浓度的蛋白质，是一种更为经济高效的选择

L-WRN细胞株参数表

细胞名称	L-WRN细胞株（小鼠皮下结缔组织细胞株）
别名	L-WRN cells；LWRN;
来源	物种：小鼠（Mus musculus）；组织：皮下结缔组织，乳晕和脂肪；性别：雄性；年龄：100天；品系：C3H/An
细胞类型	自发永生化的成纤维细胞样
形态特征	成纤维细胞样，贴壁生长
ATCC编号	CRL-3276
安全等级	2级
支原体检测	阴性
基因表达	Wnt-3A，R-spondin 3，Noggin
基因工程改造	通过R-spondin 3和noggin共表达载体转染L-Wnt3A细胞（ATCC CRL-2647）获得
分泌特性	分泌Wnt、R-spondin和Noggin蛋白
培养基	DMEM＋10% FBS+0.5 mg/mL G-418+0.5 mg/mL hygromycin B＋1% P/S
培养环境	温度：37°C；CO2：5%；湿度：饱和；生长特性：贴壁生长
传代参数	比例：1:2至1:3；频率：每周2-3次；最佳密度：80%-90%汇合度
消化酶	0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA
离心参数	1000 rpm，5分钟
冻存参数	液：完全培养基 + 5-10% DMSO；密度：5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL；温度：液氮
主要用途	生产Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin条件培养基
次要用途	用于培养各种哺乳动物组织干细胞，特别是肠道类器官
细胞活力	≥90%
无菌检测	细菌、真菌、支原体检测阴性
冻存参数	液：完全培养基 + 5-10% DMSO；密度：5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL；温度：液氮
实验对照	使用大亲代细胞系的对照条件培养基

培养教程

L-WRN小鼠皮下结缔组织细胞株培养教程

细胞复苏

将冻存管（含1 mL L-WRN细胞悬液）在37°C水浴中快速摇晃解冻。
加入4 mL预热的培养基，混合均匀。
在1000 rpm条件下离心3分钟，弃去上清液。
加入1-2 mL培养基后吹匀。
将L-WRN细胞悬液加入培养瓶或6 cm培养皿中，加入适量培养基（约4 mL）。
过夜培养，第三天换液并检查细胞密度。

细胞传代

当L-WRN细胞密度达到80%-90%时进行传代。
弃去上清：用不含钙、镁离子的PBS润洗L-WRN细胞1-2次。
消化：加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA，37°C消化1-3分钟，观察细胞变圆并脱落。
终止消化：加入2-3 mL完全培养基终止消化，轻轻打匀。
离心：1000 rpm离心5分钟，弃去上清液，补加1-2 mL培养基后吹匀。
分瓶：按1:2比例分到新的含8 mL培养基的培养瓶中，置于培养箱中培养。

细胞冻存

收集L-WRN细胞及培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm离心4分钟。
弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
根据L-WRN细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度达到5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL。
将细胞悬液分装入冻存管中，标记清楚。
逐步降温至-80°C，然后转移至液氮中长期保存。

注意事项

无菌操作：始终保持无菌操作，避免L-WRN细胞污染。
培养基更换：定期更换培养基，通常每2-3天更换一次。
条件培养基制备：收集72小时L-WRN细胞培养上清，0.2 μm过滤，储存于-20°C或-80°C，避免反复冻融。
实验对照：使用大亲代细胞系的对照条件培养基，控制实验变量。

L-WRN细胞在不同条件下的表现

1. 培养条件

标准培养条件：L-WRN细胞在DMEM培养基中，添加10% FBS、0.5 mg/mL G418、0.5 mg/mL Hygromycin B和青霉素/链霉素（PS）进行培养，生长环境为37°C，5% CO2，饱和湿度。
生长特性：L-WRN细胞在上述条件下表现出良好的贴壁生长特性，细胞形态呈成纤维细胞样。

2. 条件培养基的影响

条件培养基：L-WRN细胞能够分泌Wnt-3A、R-spondin 3和Noggin蛋白，这些蛋白对于肠道类器官的培养至关重要。使用L-WRN细胞制备的条件培养基可以提供相对完整和高滴度的蛋白质，是一种经济高效的替代品。

3. 非靶向和靶向蛋白质组学分析

蛋白质组学分析：通过结合非靶向和靶向蛋白质组学分析，可以详细了解L-WRN细胞分泌的蛋白质组。现有的测量方法主要是荧光素酶报告基因检测和其他蛋白质组学技术。