NK-92细胞系源自一名50岁白人男性的急进性非霍奇金淋巴瘤患者的外周血单核细胞。nk92细胞系是一种白细胞介素-2（IL-2）依赖性的自然杀伤细胞系，广泛应用于癌症、免疫学和毒理学研究。

NK-92细胞对多种恶性细胞表现出细胞毒性，特别在铬释放试验中展示出对K562和Daudi细胞的杀伤能力。经过辐照处理后的NK-92细胞可用于有效清除血液中的白血病细胞，而不影响造血细胞的功能。

NK-92细胞具有以下特性和特征

• 阳性标记: CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, CD54, CD56(亮)

• 阴性标记: CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, CD34, HLA-DR

• NK-92细胞对爱泼斯坦-巴尔病毒DNA序列呈阳性反应

• 分子特征：白细胞介素-2(IL-2)依赖性: NK-92细胞严重依赖IL-2生长,最低需要10U/mL维持增殖

• 细胞毒性机制：具有多种细胞毒性机制,能够通过细胞因子调节免疫反应

• 功能特征：对多种恶性细胞具有细胞毒性作用；铬释放试验显示能杀死K562和Daudi细胞；具有抗白血病、淋巴瘤、黑素瘤、前列腺癌和乳腺癌的作用

• 其他特征：细胞形态为淋巴母细胞样,呈悬浮生长；倍增时间约40-50小时；易于培养和扩增,是首个获FDA批准进行临床试验的NK细胞系

• 局限性：在肿瘤微环境中容易出现功能耗竭；缺乏CD16表达,无法产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应

NK-92细胞参数表

细胞名称	NK-92细胞（人恶性非霍奇金淋巴瘤自然杀伤细胞）
细胞别称	NK-92; NK92; Natural Killer-92; NK-92.05; Neukoplast; aNK
组织来源	人类; 外周血
细胞类型	肿瘤细胞
肿瘤类型	非霍奇金淋巴瘤
来源患者信息	50岁白人男性, 急进性非霍奇金淋巴瘤
生物安全等级	BSL-2
保藏机构;编号	ATCC: CRL-2407; DSMZ: ACC-488
生长特性	悬浮生长
细胞形态	淋巴母细胞样, 偏圆或偏椭圆, 透亮, 成团生长
培养基	MEMα基础培养基 + 20% FBS + 0.2mM 肌醇, 0.1mM β-巯基乙醇, 0.02mM 叶酸, 100-200U/mL 重组IL-2, 1% 青霉素/链霉素
培养环境	37°C, 5% CO2
推荐传代比例	5×10^5-1×10^6 cells/mL
推荐换液频率	2-3次/周
倍增时间	~40-50小时
冻存条件	冻存液: 90%FBS+10%DMSO, 温度: 液氮
表面标记(阳性)	CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, CD54, CD56(亮)
表面标记(阴性)	CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, CD34, HLA-DR
IL-2依赖性	严重依赖, 最低需要10U/mL维持增殖
细胞毒性	对多种恶性细胞有细胞毒性, 特别是K562和Daudi细胞
特殊性质	Epstein-Barr病毒DNA序列呈阳性
基因编辑	可通过CRISPR/Cas9技术进行改造, 例如嵌合抗原受体(CAR)修饰, 敲除免疫检查点基因(CBLB, NKG2A, TIGIT)等

NK-92人恶性非霍奇金淋巴瘤自然杀伤细胞培养教程

NK-92细胞复苏

• 从液氮中取出冻存的NK-92细胞，迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃以加速解冻。

• 解冻后，立即将NK-92细胞转移至含有10 mL培养基的离心管中，静置2小时以使细胞沉降。

• 小心去除上清液，保留NK-92细胞沉淀。

• 用完全培养基重新悬浮NK-92细胞，并转移至T25培养瓶中进行培养。

NK-92细胞培养

• 培养条件:温度: 37°C、CO₂浓度: 5%、气相: 空气95%，CO₂ 5%

• 生长特性: NK-92细胞以悬浮形式生长，细胞多聚集成团，少数分散。

NK-92细胞换液

• 换液频率:

• 初期（复苏后的1周内）每1-2天换液1-2次。

• 随后视NK-92细胞密度和培养基颜色，每2-3天换液一次。

  换液方法:

• 使用“沉降法”：将培养基连同NK-92细胞团轻柔转移至离心管中，静置10-20分钟，待细胞团沉降后小心去除旧培养基。

• 初次换液可采用“半换液”方法，即保留一半旧培养基，补加等量新鲜培养基。

NK-92细胞传代

• 传代时机: 当NK-92细胞达到对数生长期，且细胞密度在5×10^5至1×10^6 cells/mL之间。

• 传代步骤:采用沉降法收集NK-92细胞团。用新鲜培养基重悬NK-92细胞团，转移至新的培养瓶中。

6. NK-92细胞冻存

• 冻存液: 90% FBS + 10% DMSO。

• 收集NK-92细胞团，重悬于冻存液中。

• 将NK-92细胞分装于冻存管中，迅速放入-80°C冰箱中冷冻24小时。

• 之后转移至液氮中长期保存。

NK-92细胞培养注意事项

• 细胞敏感性: NK-92细胞对机械损伤非常敏感，尽量减少离心次数，避免直接倒掉培养液。

• 细胞团处理: 在换液和传代过程中，避免打散NK-92细胞团，以保持细胞活力。

• 监测细胞状态: 定期观察NK-92细胞形态，确保细胞团的健康状态，避免出现死细胞和细胞碎片。

NK-92细胞培养的关键措施

优化IL-2补充:

• 使用高质量的重组IL-2，浓度保持在100-200 U/mL。

• 定期补充新鲜IL-2，建议每周至少2-3次。

采用"沉降法"进行换液和传代:

• 避免使用离心法，减少对NK-92细胞团的机械损伤。

• 静置10-20分钟让NK-92细胞沉降，小心去除上清液，保留细胞团，添加新鲜培养基。

控制细胞密度:

• 保持NK-92细胞密度在5×10^5-1×10^6 cells/mL之间。

• 定期观察细胞团大小，避免细胞团过大导致营养不足。

维持适宜的培养环境:

• 温度保持在37°C，CO₂浓度5%。

• 使用高质量的培养基和血清。

基因编辑改造:

• 可通过CRISPR/Cas9技术敲除免疫检查点基因（如CBLB、NKG2A、TIGIT），提高NK-92细胞的适应性和抗肿瘤能力。

减少机械损伤:

• 避免频繁离心和过度吹打NK-92细胞。

• 轻柔操作，保持NK-92细胞团完整性。

定期监测细胞状态:

• 观察NK-92细胞形态，确保细胞团呈白色透亮状态。

• 评估NK-92细胞活性和功能，如细胞毒性试验。