一. 准备培养基和冻存条件：

• 准备RPMI-1640培养基，添加NaHCO3 1.5g/L，D-葡萄糖2.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L，混合后加入优质胎牛血清（10%）。

• 设置培养条件为气相：95%空气+5%二氧化碳，温度为37摄氏度，湿度保持在70%-80%。冻存液为90%完全培养基+10%DMSO，储存在液氮中。

二. 细胞处理：

• 复苏细胞：将NCI-H1975细胞（人肺腺癌细胞）冻存管中的细胞悬液在37摄氏度水浴中迅速解冻，加入4ml培养基混合均匀后离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后吹匀。将所有细胞悬液加入培养瓶中或10cm皿中培养过夜。

• 细胞传代：

贴壁细胞：弃去培养上清，用PBS润洗细胞1-2次，加入0.25%Trypsin-0.53mM EDTA消化1-2分钟，消化后立即加入少量培养基终止消化，然后分到新的含8ml培养基的新瓶或皿中。

悬浮细胞：收集细胞后，离心4分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后吹匀，然后分到新的含8ml培养基的新瓶或皿中。

三. 细胞冻存：

• 待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

• 贴壁细胞冻存时，加入少量胰酶，细胞变圆脱落后加入约1ml含血清的培养基后冻存。

• 悬浮细胞冻存时，收集细胞后，加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，加入10%DMSO后冻存。