HKF(SV40)人瘢痕疙瘩成纤维细胞是通过手术切除的瘢痕疙瘩组织培养，并通过慢病毒介导的SV40基因转染实现永生化。瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕，具有侵袭性和高复发率，其中成纤维细胞在其形成和发展中起关键作用。在适宜的条件下，HKF-SV40细胞可以稳定传代至少20代以上。HKF细胞系是研究瘢痕疙瘩的病理机制以及开发相关治疗的重要工具。

HKF人瘢痕疙瘩成纤维细胞特性特征

• HKF(SV40)细胞在适宜条件下能够稳定传代20代以上，表现出较低的血清需求，能够在无锚着依赖的条件下生长，甚至在软琼脂中形成克隆。

• 增殖能力：由于SV40大T抗原的转染，细胞增殖能力显著增强，克服了正常成纤维细胞的衰老限制。

• SV40大T抗原：SV40大T抗原是该细胞系的关键转染因子，能够与细胞周期调控蛋白（如p53和Rb）结合，从而抑制它们的抑制作用，促进细胞的增殖和生长。

• 大T抗原的作用机制包括：激活宿主细胞的DNA合成。诱导细胞周期进程，促进细胞增殖。

• 基因表达：转染SV40后，细胞中大T抗原的表达量显著增加，这导致HKF细胞在增殖和生长方面的特性发生变化。

• 端粒酶活性：SV40转染的成纤维细胞中观察到端粒的增长，表明HKF细胞可能具备端粒酶活性，这与其永生化特性密切相关。

HKF细胞SV40永生化参数表

HKF人瘢痕疙瘩成纤维细胞SV40永生化培养教程

HKF细胞的复苏与初代培养

• 解冻细胞：将冷冻的HKF细胞迅速置于37°C的水浴中解冻，轻轻摇晃使其完全融化。立即将细胞悬液转移至预先准备好的15ml离心管中，加入10ml完全培养基。

• 离心与重悬：以200g离心5分钟，弃去上清液。用5ml完全培养基轻轻重悬HKF细胞，确保细胞不受损伤。

• 接种细胞：将重悬后的HKF细胞悬液转移至T25培养瓶中，加入8ml完全培养基，轻轻摇晃以确保细胞均匀分布。

• 培养条件：将培养瓶置于37°C、5% CO2培养箱中培养。24小时后观察HKF细胞的贴壁情况，若贴壁不完全，轻轻吸去旧培养基，加入新鲜完全培养基。

• 培养基更换：每2-3天更换一次培养基，直至HKF细胞生长至80%汇合。

HKF细胞的传代

• 细胞洗涤：当HKF细胞生长至80%汇合时，小心吸去培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞两次，以去除残余的血清和其他杂质。

• 消化细胞：加入2ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37°C孵育2-3分钟，直至HKF细胞开始从培养瓶壁上脱落。

• 终止消化：加入5ml完全培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。用移液枪轻轻吹打，确保HKF细胞完全分散。

• 离心与重悬：将HKF细胞悬液转移至15ml离心管中，以200g离心5分钟，弃去上清液。用5ml完全培养基重悬HKF细胞，并计算细胞数量。

• 重新接种：根据需要的接种密度，将HKF细胞悬液分配至新的培养瓶或培养皿中，加入适量的完全培养基。

• 持续培养：将培养瓶或培养皿放回培养箱中，每2-3天更换培养基，直至HKF细胞再次生长至80%汇合，重复上述传代步骤。

HKF细胞的冻存

• 细胞收集：从培养瓶中收集处于对数生长期的HKF细胞，转移至离心管中，以200g离心5分钟。

• 准备冻存液：弃去上清，用冻存液（90% FBS + 10% DMSO）重悬HKF细胞，调整细胞浓度为1×10^6-1×10^7 cells/ml。

• 冻存步骤：将HKF细胞悬液分装至冻存管中，置于-80°C冰箱中预冻存24小时。

• 长期保存：将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存，以确保HKF细胞的存活和稳定性。

注意事项

• 在HKF细胞传代过程中要注意避免过度消化，以免损伤细胞活性。

• 冻存液中的DMSO对细胞具有一定的毒性，需确保冻存过程快速进行，并尽快将HKF细胞转入液氮保存。

• 复苏后初代培养时，要特别注意培养基的更新，确保HKF细胞能够适应体外环境并快速贴壁生长。