纯化后的酶由于脱离了其天然的细胞环境，变得非常脆弱，容易失活。选择合适的保护剂和保存条件是维持酶活性的关键。保护酶活性的策略主要围绕抑制导致酶失活的因素展开，包括：变性、氧化、蛋白水解、微生物污染等。玉珠隆生物小编对保护剂选择和保存策略进行了汇总。

一、 核心保护策略与常用保护剂

1. 防止蛋白变性（稳定结构）

这是最常见的失活原因，通常由温度、机械力或极端pH引起。

甘油 (Glycerol)：最常用的保护剂之一。通常使用50% (v/v) 的浓度。它能增加溶液的粘度，降低分子运动，有效防止蛋白在低温下变性，并能降低溶液的冰点，避免反复冻融造成的损伤。

蔗糖、海藻糖 (Sucrose, Trehalose)：这些糖类通过“优先排斥”效应，迫使水分子更紧密地包围在酶分子周围，稳定其天然三维结构。海藻糖尤其以其卓越的稳定性著称。

血清白蛋白 (BSA)：牛血清白蛋白（BSA）作为一种“惰性”蛋白，可以吸附在试管壁或酶分子上，减少酶蛋白自身的吸附和聚集，从而起到稳定作用。它还能抑制蛋白水解。

多聚物 (Polymers)：如 PEG（聚乙二醇），通过空间位阻效应和改变溶液性质来稳定酶。

2. 防止氧化

酶活性中心的巯基（SH）或甲硫氨酸极易被氧化。

二硫苏糖醇 (DTT)：强还原剂，能有效保护巯基，但本身在溶液中不稳定，易被氧化，需要定期补充。

β-巯基乙醇 (β-Mercaptoethanol)：作用与DTT类似，但效果较弱，气味较大。

还原型谷胱甘肽 (Glutathione, reduced)：生物体内天然的抗氧化剂，较为温和。

EDTA (乙二胺四乙酸)：一种金属螯合剂。它可以螯合溶液中的重金属离子（如Cu²⁺, Fe²⁺），这些离子可能催化氧化反应或成为蛋白酶的辅因子。EDTA常与其他保护剂联用。

3. 抑制蛋白水解

纯化过程中可能混入微量蛋白酶。

蛋白酶抑制剂 (Protease Inhibitors)：针对不同类型的蛋白酶使用特定的抑制剂。常见的有：

PMSF (苯甲基磺酰氟)：强烈抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）和某些半胱氨酸蛋白酶。毒性很强，需谨慎操作。

EDTA：通过螯合金属离子（如Zn²⁺, Ca²⁺）来抑制金属蛋白酶。

亮抑酶肽 (Leupeptin)、抑肽酶 (Aprotinin)等：抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。

使用非常“干净”的纯化体系，避免引入外源蛋白酶。

4. 维持最适pH（缓冲系统）

pH波动会改变酶分子的电荷分布，导致变性。

选择合适的缓冲液 (Buffer)：如Tris-HCl,磷酸盐缓冲液(PBS), HEPES等。关键是确保缓冲液在储存温度下的pKa值接近您需要的pH值（例如，4°C时Tris的pKa会变化）。

保持适当的离子强度：通常使用50~150 mM的NaCl或KCl 来维持一定的离子强度，防止酶因静电作用而聚集。

5. 防止微生物污染

NaN₃ (叠氮钠)：非常有效的抗菌剂，常用浓度为0.02% (w/v)。注意：剧毒，易穿透皮肤，避免吸入和接触。对于涉及细胞实验的酶，不能使用NaN₃。

抗生素：如青霉素链霉素混合液。

6. 提供辅因子

有些酶需要特定的辅因子或金属离子才能保持稳定。

Mg²⁺：对于许多激酶（Kinase）和ATP酶是必需的。

Ca²⁺：对于某些蛋白酶（如胰蛋白酶）的稳定性很重要。

Zn²⁺：是许多金属酶（如碳酸酐酶）的组成部分。

二、实用保存方案（如何组合使用）

1. 短期储存（几天到几周）：

置于4°C。

在合适的缓冲液中（如50 mM Tris-HCl, pH 7.5）。

加入50% (v/v) 甘油。

加入0.5~1 mM EDTA 和0.5~1 mM DTT（如果酶对氧化敏感）。

加入0.02% NaN₃（如果允许）。

2. 长期储存（数月到数年）：

20°C保存：必须与50%甘油 混合，防止形成冰晶和反复冻融造成的破坏。

80°C保存：这是最推荐的长期储存方式。可以将酶液在最佳缓冲液中（已含所有保护剂）分装成小份（避免反复冻融），直接放入80°C超低温冰箱。快速冷冻（用液氮或干冰/乙醇浴）有助于形成更小的冰晶。

液氮冷冻：对于极其珍贵的样品，这是最可靠的方法。

3. 冻干 (Lyophilization)：

将酶溶液在真空下冷冻脱水。冻干后的酶粉非常稳定，可在20°C或4°C下长期保存。

冻干过程中通常需要加入稳定剂，如蔗糖、海藻糖或BSA，作为赋形剂，防止酶在脱水过程中失活。

三、 关键注意事项与决策流程

1. 避免反复冻融！ 这是导致酶活性丧失的首要元凶。务必将酶溶液分装成小份储存，每次使用时只取一管。

2. 查阅文献：您研究的酶很可能已有成熟的保存方案，这是最快捷有效的途径。

3. 进行预实验：如果不确定，可以设置几个不同的保护剂组合，在不同温度下储存，并在不同时间点测定酶活，以确定最优条件。

4. 注意相容性：确保保护剂不会影响您后续的酶活检测实验。例如，NaN₃会抑制许多依赖于氧化还原反应的检测方法；高浓度的甘油或DTT可能会干扰光谱测定或色谱分析。

小编建议，在对纯化后的酶进行保存时，可以参照如下流程：

第1步：将酶分装。

第2步：置于合适的缓冲液中（pH、离子强度）。

第3步：默认加入50%甘油和1 mM EDTA（除非有冲突）。

第4步：如果酶含巯基，加入1 mM DTT 或 β巯基乙醇。

第5步：长期储存选择80°C；短期可用20°C (必须含甘油) 或4°C。

第6步：根据需要加入NaN₃防止污染。