前言：

都说防患于未然，上医治未病，善战者无赫赫之功。提到前因后果，很多文章从“后果”的角度分析了WB实验上游可能的失误原因。那我们直接从“前因”来看，哪些步骤疏忽大意或者没有严格按要求操作会导致后续失败和难看的WB结果图呢？目前看来，近十年遇到的失败经验表明，一抗选择和制胶质量是最重要的两个因素。

常见错误问题详版：

抗体验证

1.抗体要买对

● 一抗是最要小心的。二抗（包括避开重链的或者避开轻链的二抗），内参抗体，标签抗体，HRP直标的内参或者标签抗体，不容易出错。

● 一抗可以在CiteAb网站上比较不同抗体的文章引用数，或参考高影响因子文章，或给通讯作者联系直接问，或找靠谱的年份久的经销商免得有假货，同样靶蛋白的抗体尽量买口碑好的公司和品牌，或者有参考文献明确的，或者问问周边的同学同事有用过的靠谱的。

● 有时候还需要选择多功能的抗体，除了WB，还可能要做免疫荧光，流式，Co-IP，ChIP，RIP，IHC组化等实验。

● 之前遇到同一货号的抗体，同批次的卖完了，就买了新批次的，结果完全做不出来检测不到，那卖抗体的公司新批次产品就不做质检和质控的嘛？！怎么好意思拿出来卖的？！严重耽误时间。

● 有的公司，抗体说明书标注的可检测的物种都做不出来，更可气的是检出的还是杂带，杂带的大小和主带还非常接近，造成严重误判，影响研究方向，耽误至少半年时间以上。核心抗体一定要自行验证，确保准确可靠。

● 没有商业化抗体的时候，会找公司定制抗体，例如涉及昆虫等的研究，验证的时候一定要做目的蛋白带HA、Flag或者Myc标签的过表达验证，直接检测，做不出来搞不清楚原因，还以为是WB手艺不行，浪费时间。

● 一旦涉及信号通路，你不可能所有的抗体都去做过表达和敲除的验证。但是核心的实验，决定研究方向的实验，对应的蛋白，必须要过表达和敲除，验证确保抗体有效。

制胶均匀

2.试剂要靠谱

● 10%的过硫酸铵（APS）水溶液容易出问题，会逐渐分解，配置后4℃放置1周以内使用，不然可能导致蛋白胶凝固时间延长，胶不均匀，后续条带弯曲。APS本身容易受潮分解，注意存放，保持干燥。

● 30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（29:1），也可能出问题，导致胶凝固时间延长，胶不均匀。要么是过期了，要么是公用的结果有人室温放久了。

● 公用的东西容易出问题，还有人把需要室温保存的10%SDS放冰箱的，直接结晶析出，重新溶解耽误时间。

● 制胶用的高压灭菌过的超纯水，有时候放的长菌了，有杂质了。

3.配方要准确

● Western blot上篇Protocol的来源于Takara的配方是OK的，就是有人制胶的时候可能会看错行，搞错用量或者浓度。

4.制胶要干净

● 制胶不均匀是绝大部分后续条带异常的罪魁祸首。要么试剂坏了污染了（配胶全套试剂）和要么设备坏了破损了（玻璃，夹板，胶条，液封，梳子）。

● 公用的玻璃板，只要有一个人瞎操作不爱惜，就会把所有的玻璃板下边缘给磕坏，全是磕的破口子，造成制胶漏液的极大风险。

● 胶条长期使用，表面会破损有微小孔洞，加上玻璃的破损，无法密封，漏胶或者凝固过程中有气泡升上去。

5.胶浓度合适

● 根据目的蛋白大小和内参的位置选择，小蛋白选择高浓度分离胶可以到15%，大蛋白选择低浓度分离胶可以到8%。

样品处理

6.样品要新鲜

● 组织或细胞收样制备蛋白样品后，尽快跑胶检测，不要长时间冰箱放置，低丰度蛋白一旦降解更难检测到了。

● 该加的抑制剂要加全乎了，有的蛋白裂解液本身是含有蛋白酶抑制剂或者磷酸酶抑制剂的。

● 样品粘稠的问题，有离心取上清的，有超声助溶的，也有加全能核酸酶的效果很好，也有无所谓直接加5xLoading煮的。

7.上样量合适

● BCA测蛋白浓度控制上样总微克数，这里今后可以补一个Protocol。或者偷懒一点点的办法，收蛋白前细胞计数，按照细胞量和裂解液收样体积，也可以估算，保持上样细胞数一致，大致能保持内参一致。● 其实BCA测蛋白浓度后按微克数上样，最后内参还是不一定准确一致的。重要样品或者最好是预先跑一块胶看内参条带强弱，计算一下相对灰度值，再根据内参的灰度值来计算调整每个样品的上样量，确保后续跑胶的内参一致性。

● 如果上样量过多，跑胶时可以看到浓缩胶的胶孔跑过后会挤压成弧形。结果呈现出来的是目的条带过强，条带粗壮，对应分子量大小位置有偏差，或者杂带众多。

● 上样量最左边和最右边的两个孔对应的条带容易弯曲倾斜，但凡有空位就靠中间上样，把两边最边上的孔空出来或者Marker用。

跑胶、转膜、封闭、一抗、二抗、洗膜、曝光

8.浓缩胶压齐

● 大概20-30分钟等浓缩胶跑完，把蛋白压齐到分离胶上边缘了，再加大电压，跑分离胶。

9.转膜无气泡

● 转膜的时候，胶和膜之间，气泡刮不干净，有气泡的地方转膜转不过去，最后出的图就是条带有小空泡，而且多半小空泡刚好就在目的条带上，人生就是这么荒诞。

● 转膜用新配的转膜液，但是转膜滤纸用的时间久了，会有小碎屑漂浮到转膜液里，尽量避免，及时换新。

10.湿转要冰浴

● 槽子里加小冰袋或者小冰盒，外面放盆子里，四周加冰，还要加点水，冰水混合物，免得有空隙，湿转过热，后面曝光条带也是一堆问题。前面的关键点都注意到了预防了，后面即使出问题也好分析原因。

● 半干转也用过，速度很快，但是很容易造成短路，温度过高把槽子的塑料部分给热变形。

11.封闭液混匀

● 一般是用5%脱脂奶粉就够了，也有买商品化封闭液的都行，主要是自己配置的脱脂奶粉要摇匀完全溶解，有渣点点，封闭用了，最后就会反映在图上。

12.一抗冷过夜

● 一抗可能本身含有抗菌剂，买的一抗稀释液或者5%脱脂奶粉，短时间内再做可以放4℃，不然用完冻存-20℃，这样一抗可以重复用几次，或者第二次做孵育仅添加少量一抗。

● 看实验目的了，特别是转录因子那些低丰度蛋白，4℃摇床过夜孵育一抗效果更好。

13.洗膜时间够

● 赶时间的时候可能洗不够5分钟，做实验的哪有天天好心情，特别是催着要结果的时候。

14.曝光摆整齐

● 曝光的时候就按照Marker的条带位置，横平竖直摆整齐不好吗，省得后面截图的时候又要旋转图片调整位置。

● 甲醇激活前，PVDF膜的右上用剪刀剪个小角角，或者铅笔写字标注，区分正反面。夹取膜的右上角，抖抖水，用卫生纸吸附掉多余的液体，不要刮擦到含有蛋白的那一面，也不要放的太干了，洗膜液吸附的差不多就拿去曝光了。干过了的地方，曝光不出来，图片完蛋。

● 像Bio-Rad的曝光台的玻璃板，本身就是带点疏水的（不知道这样描述是否正确），滴加ECL发光液后，再贴附PVDF膜，正反面都蘸一蘸，铺好，上面再滴加ECL发光液覆盖。

● 像Bio-Rad的曝光仪有最快曝光模式，最优曝光模式，时间点单拍模式，时间段连拍模式，还可以显示是否过曝。一般最优曝光模式就行。有时候需要正常曝光和过曝条件同时，就用时间段连拍模式。

● 看到过删不想要的图的时候，把需要留下的好图一起勾选给删掉了，没有垃圾箱找回的，完蛋。

15.酸洗孵内参

● 有时候样品量不够，先曝光目的蛋白，再用洗膜液去除一抗二抗后，重新从封闭的步骤开始做检测内参蛋白，同一张膜上检测内参的相对蛋白含量，比跑两张分别孵育目的蛋白和内参的准确性更高。中性、碱性都有，但是目前只用过酸性洗膜液，效果还可以。这里今后可以补一个Protocol。

16.打扫实验台

● 养成好的实验习惯，利己利人。用过的玻璃板、梳子、胶条、架子、夹板、小冰盒和槽子用水洗干净，实验台擦干净。特别是玻璃板，容易残留胶干在上面的。

常见错误问题简版：

1.一抗买的不行，没主带，全杂带，八筒冒充九筒。

2.玻璃板没洗干净，拖带，没对齐或者有破损，漏胶。

3.橡胶垫破损，漏胶，不要死磕买新的尽快。

4.部分试剂或者水存放不当，失效或者有杂质污染，纵向彗星拖尾。

5.10%APS放的时间久失效，胶不凝固。

6.加浓缩胶前，分离胶上层的水或者无水乙醇没弄干，样品跑到分层处开始横着跑。

7.上样量过低或者过多，检测不到主带，主带太粗，很多杂带。

8.最左侧和最右侧的上样孔，跑胶后条带容易倾斜弯曲，可以跑Marker，尽量不要跑样品。

9.跑胶时间不够，条带离得太近；跑胶时间过久，条带跑没了。

10.PVDF膜忘了没有经过甲醇激活，转膜失败。

11.转膜时胶和膜之间的气泡没排干净，最后曝光会有小空泡在目的条带上。

12.转膜时间不够，看Marker就知道，目的蛋白还没有完全转过去。

13.湿转需要的冰袋和冰水降温，外面冰里加些水，不要全是冰，有空腔不利于转膜槽降温，后续条带弥散。

14.封闭液，5%脱脂奶粉，容易未完全溶解，后期造成图上密密麻麻的黑点。

15.一抗的比例看说明书合适，通常4℃摇床过夜效果更好。

16.洗膜时间不要偷懒，不然图片背景黑乎乎的不干净。

17.选择合适的显影液，合适的曝光模式，有时候过强的条带适合用弱显影液，不然烧条带，条带中间迅速变成空心。

18.正常操作的情况下的各种低级错误，包括试剂上，加多、加少、漏加、加错；时间上，跑短了、跑没了、转短了、转没了；温度上，该低温的、该室温的、该煮沸的。